01 ATAC-seq 原理介紹

染色體結構

人類基因組DNA直線長度接近2m，而細胞的平均直徑一般在幾十微米，要保證DNA的復制和基因表達調控能夠準確、高效的進行，需要將細胞核中的DNA經過多個水平高度有序的包裝。

2個H3-H4二聚體和2個H2A-H2B二聚體形成約11nm的組蛋白八聚體，DNA纏繞其上形成核小體，每個核小體上大約含有146bp的DNA，核小體相互串聯成為30nm水平纖絲染色質。細胞周期的不同時期，染色質濃縮程度不同，在分裂間期，染色質相對松散，具有轉錄活性的同時DNA暴露區域也可被特定的核酸酶接近并切割，而在分裂期，染色質進一步包裝為結構緊密的染色體狀態，此時呈現出轉錄惰性。

染色質可接近性概念

染色質分為常染色質和異染色質，在結構上常染色質折疊壓縮程度低，處于伸展狀態。DNA復制、基因轉錄時，DNA的致密高級結構變為松散狀態，這部分打開的染色質，稱之為開放染色質（open chromatin）。染色質一旦被打開，就允許一些調控蛋白，比如轉錄因子和輔因子與之相結合，染色質的這一特性，就叫做染色質可接近性（chromatin accessibility）。這一特性反映了染色質轉錄活躍程度。特定條件下的染色質開放性變化可以提供大量的基因表達調控信息。

 Nature Reviews Genetics, 2014, 15(4):272.

  圖2：染色質的可接近性轉換

轉錄因子及基因表達調控

真核生物轉錄調控過程是大量的順式作用元件與反式作用因子相互作用的結果，具有調控功能的反式作用因子通過結合染色質開放區域調控真核細胞基因的表達。轉錄因子識別并結合起始位點上游序列，如GC Box、CAAT Box和TATA Box等順式作用元件，從而啟動基因的開放表達。遠端調控的增強子，沉默子、絕緣子同樣也可以通過結合順式作用元件參與調控基因表達的開放和關閉。轉錄因子與基因組結合時，取代了核小體的位置，暴露出DNA，使其對酶的切割更為敏感。在此基礎上，利用染色質對DNase的敏感性，鑒定活化的調控序列。基因表達調控是一個動態平衡的過程，在轉錄和翻譯中，染色體三維結構也會處于動態變化中。 

全基因組染色質可接近性研究       

目前染色質可接近性的研究方法主要通過酶解或者化學方法來分離可接近區域或者受保護區域的DNA序列，然后再經過高通量測序分析。轉座酶引入高通量測序之前，基因組范圍內染色質可接近性的研究方法主要包括 MNase-seq，DNase-seq和FAIRE-seq，這些方法可以幫助我們在大量的細胞系和組織樣本中鑒定出轉錄因子的結合位點、轉錄活性開始的位置、核小體和核小體修飾、增強子和絕緣子等。

MNase-seq：微球菌核酸酶（Micrococcal nuclease，MNase）是一種限制性外切酶，進行片段化處理時，將DNA切成缺口后，逐個切除寡核苷酸，直到獲得被核小體包裹或者被轉錄因子綁定的區域為止。目前MNase消化法和二代測序聯合使用，通過定性和定量的方式來識別基因組范圍內的平均核小體占據率、定位以及染色質開放區域。

                                    圖4：MNase-Seq原理圖

DNase-seq：基因活躍表達時啟動區域部分序列可能解旋成單鏈，從而不能繼續纏繞在核小體上，使啟動區DNA裸露在組蛋白表面，形成對DNaseI的超敏現象。容易被DNase｜切割的位點稱為超敏感位點。這些位點是調控元件如啟動子、增強子、絕緣子和轉錄因子等的結合位點。DNase-seq技術與MNase-seq技術互補，利用DNase｜優先切割超敏感位點然后對生成的片段進行測序。該方法可用于檢測特定轉錄因子等結合位點。

FAIRE-seq： FAIRE （Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements）甲醛輔助分離調控元件，是借助有機溶劑甲醛對染色體中裸露的DNA 進行固定，通過細胞裂解與超聲打斷再進行CHCL3抽提獲取水相中的DNA，在CHCL3抽提的過程中，蛋白未交聯的DNA溶于水相中，而蛋白結合型的DNA留在兩相界面，實驗準備時間3-4天。將FAIRE-seq與ChIP-seq、DNase-seq聯用可以用于揭示轉錄因子結合位點、核小體位置分布、染色質開放區域以及三者之間的關系。

這些研究染色質開放區域、核小體定位、轉錄因子占位或者染色質生物學“狀態"的注釋方法都涉及多個試驗流程，操作復雜，需要大量細胞作為研究樣本，并且樣本準備過程非常繁瑣。

為了解決這些問題，2013年Standford 大學 William Greenleaf 實驗室的Buenrostro等發布了一項整合的、多維的遺傳學分析方法-ATAC-seq，這種方法通過Tn5轉座酶將測序的adapters插入到基因組上的“可接近"區域來標記調控區域。

ATAC-seq

ATAC-seq 全稱 Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing，是利用轉座酶研究染色質可接近性的高通量測序技術。其原理是利用轉座酶Tn5可切割開放染色質區域的特性，對Tn5酶捕獲到的DNA序列進行測序。DNA轉座，是把DNA序列從染色體的一個區域搬運到另外一個區域的現象，由DNA轉座酶來實現。只要人為地將攜帶已知DNA序列標簽的轉座復合物（即下圖中帶紅／藍色序列標簽的轉座酶Tn5復合物）與細胞核一起孵育，再利用帶P5、P7以及index的引物進行PCR擴增即可形成文庫，經過測序就可以得到開放染色質的區域信息。

ATAC-seq 可低至20個細胞便能快速的獲取調控的多維信息，更加適用于珍貴稀少的樣本，且ATAC-seq無片段選擇性，所以這種方法可以同時獲得“開放"染色質的位置、轉錄因子的結合位點、核小體的調控區域和染色質狀態等信息。

相對于其他三種染色質開放區域研究，ATAC-seq經過一次實驗，能夠獲得染色體在某個特定時空條件下所有開放染色質區域，并不僅僅局限于某個轉錄因子的結合位點，或者某個特定的組蛋白乙酰化區域。

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