要做好CCK-8實驗，這三個重要環節請注意

在做細胞基礎實驗時，必要的一步就是需要探究清楚細胞的增殖變化和毒性耐藥變化情況，為下一步實驗做準備。

我們在做CCK-8增殖和毒性實驗中常常會遇到一下幾個問題：

1.細胞鋪板問題 2.給CCK-8的方式問題 3.CCK-8的反應時間問題

首先，在進行細胞鋪板時， 需要用血球計數板進行細胞計數，得到細胞數量后按照所需鋪板的細胞數量進行調整。一般96孔板鋪板數量為1*10^6/孔。

制備細胞懸液時需要反復吹打，使細胞懸液充分混勻，降低出現細胞團塊的幾率。一般96孔板，每孔加入100微升細胞懸液，從孔的9點鐘方向打入，加入半張板子時，需要再次將細胞吹勻，然后繼續加剩余的孔。

待全部加入完畢時，蓋上蓋子，放入培養箱。（細胞的均勻鋪被是本實驗成功的大前提）。

其次，是細胞的處理。一般給CCK-8有兩種方式：第一種是直接每孔加入10微升的CCK8原液；另一種則是配置含10%的CCK-8培養基，以換液的形式加入孔板。

第一種方式的弊端在于10微升的CCK-8量比較少，可能因沾在孔壁導致誤差的出現。

第二種方式可以避免上述情況的發生，但操作過程中仍需注意10%的CCK-8培養基需要現配現用；其次打入100微升的CCK-8時沿著孔壁將槍頭伸入液體緩緩打出，再移出槍頭。

期間可能會產生小氣泡，需要用無菌針頭燒紅插入氣泡，消除氣泡。（氣泡會影響OD值，因此應該盡量消除）。

最后，就是反應時間問題。將孔板放入培養箱培養1-4小時，引細胞種類和數量的差異，可能形成的Formazan的量不一樣。因此需要把握好培養的時間。

我的經驗是：在培養2h后，取出孔板，每孔抽取90微升加入至新孔板，進行第一次檢測，看看顯色的深淺程度（仍然需要注意氣泡，若有氣泡需要待氣泡消除后再進行檢測）

若顯色較淺，則可除去舊培養基，加入新培養基，再培養1-4小時，重新加CCK-8步驟，然后將其放入培養箱培養4小時，再進行檢測（其最佳反應時間為0.5、1、2小時）

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