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人胚胎干細胞傳代培養(yǎng)

發(fā)布時間： 2023-01-12　　點擊次數(shù)： 1650次

簡介
胚胎干細胞是具有一種具有自我更新和全能分化能力的細胞，能發(fā)育分化出成體所有的組織和器官，是體外研究發(fā)育調(diào)控機制理想的模型，也是用于人類疾病的干細胞治療和器官組織移植理-想的種子細胞。建立新的人類胚胎干細胞系仍然有很大的倫理學爭議，目前對人胚胎干細胞的研究主要就是基于已經(jīng)建立的人胚胎干細胞系的研究。
原理
人胚胎干細胞傳代培養(yǎng)的原理是人胚胎干細胞快速生長和擴增，而細胞培養(yǎng)箱恰恰能提供培養(yǎng)所需的環(huán)境。
用途
胚胎干細胞常用于發(fā)育分化出成體所有的組織和器官，是體外研究發(fā)育調(diào)控機制理想的模型，也是用于人類疾病的干細胞治療和器官組織移植理-想的種子細胞。
材料與儀器
器材：

①37 ℃ 水浴鍋

②一次性無菌培養(yǎng)皿

③一次性無菌移液管

④T75培養(yǎng)瓶

⑤15 mL 離心管、注射器和針頭

⑥涂有明膠的6 孔板

試劑：

①材料：提前制備好的飼養(yǎng)層細胞

②95％乙醇
步驟
人胚胎干細胞傳代培養(yǎng)的基本過程可分為如下幾步：

（一）試劑配制

（1）膠原酶溶液的配制使用濃度1 mg ／mL 。膠原酶，30mg；DF12培養(yǎng)基，30 mL 。使膠原酶充分溶解于DF12基礎培養(yǎng)基。用0.22 μm 濾器過濾除菌。

（2）胚胎干細胞培養(yǎng)基的配制DF12培養(yǎng)基，200 mL ；血清替代物50 mL ；200 mmol ／L -谷酰胺＋2-巰-基-乙-醇溶液，1.25 mL ；非必需氨基酸100x溶液，2.5 mL ；b-FGF 溶液，5 mL 。
所有組分都加入250ml培養(yǎng)瓶中，用0.22μm濾器過濾除菌。培養(yǎng)基最好在2周內(nèi)使用。

（3）200 mmol ／L -谷酰胺＋2-巰-基-乙-醇溶液的配制200 mmol ／L -谷酰胺，5 mL ；2-巰-基-乙-醇，7 μl ，混勻。

（4）b-FGF的配制b-FGF，10 μg ；0.1％BSA無菌，5 mL 溶解后按0.5 mL 每份分裝冷凍保存。

（二）確定傳代時機

通常以下情況時，胚胎干細胞需要傳代

①小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）飼養(yǎng)層超過2 周。

②胚胎干細胞的克隆密度太高或克隆大小太大。

③胚胎干細胞克隆出現(xiàn)分化現(xiàn)象。

（三）膠原酶處理

（1）需要傳代時，將胚胎干細胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱取出，吸去培養(yǎng)上清。

（2）6 孔板培養(yǎng)時，每個孔加1 mL 膠原酶溶液。

（3）處理至少5 min 。

（4）倒置顯微鏡下觀察，直至細胞克隆從培養(yǎng)板表面脫離。注意：可以看到克隆周邊會出現(xiàn)皺褶。根據(jù)消化情況，膠原酶處理時間可再延長6～10 min 。
（四）刮細胞

（1）用5 mL 玻璃移液管，將細胞從培養(yǎng)板表面刮下來。

（2）同時輕輕吹打膠原酶溶液，使細胞從培養(yǎng)板上面完-全脫離。

（3）所有細胞團都留在培養(yǎng)板中，直到整個6 孔板都按步驟（1）、（2）處理完。
注意：這些步驟可以直視下完成，也可以在解剖纖維鏡下完成。
（五）收集并打散克隆

（1）將整塊6 孔板的細胞都轉(zhuǎn)移到一個15 mL 離心管中。

（2）每個孔加1 mL 胚胎干細胞培養(yǎng)基沖洗，并將沖洗液也轉(zhuǎn)移到細胞懸液中。

（3）在15 mL 離心管中，輕輕吹打細胞懸液數(shù)分鐘，進一步打散細胞克隆。注意：吹打時避免產(chǎn)生氣泡。
（六）離心傳代

（1）將打散的細胞克隆，200 g 離心5 min 。

（2）去除上清液。

（3）輕輕拍散細胞團，加2～3 mL 胚胎干細胞培養(yǎng)基重懸細胞，輕輕混勻。

（4）200 g 離心5 min 。

（5）胚胎干細胞離心同時，將提前準備好的飼養(yǎng)層培養(yǎng)板取出，吸棄MEF培養(yǎng)基。

（6）用6 孔板培養(yǎng)的飼養(yǎng)層，每個孔加1 mL PBS，輕輕晃動，洗去培養(yǎng)基中所含的血清。
注意：PBS處理成纖維細胞的時間不要超過6～10 min 。

（7）胚胎干細胞離心結(jié)束后，棄去上清液，輕輕拍散細胞團。

（8）加入2～3 mL 胚胎干細胞培養(yǎng)基，重懸細胞。

（9）再加入足夠的胚胎干細胞培養(yǎng)基，使6 孔板的每個孔細胞懸液體積為2.5 mL 。

（10）去除飼養(yǎng)層培養(yǎng)板中的PBS，每個孔加入2.5 mL 細胞懸液，用移液管輕輕混勻。

（11）在水平臺面上，短促地上下左右地晃動培養(yǎng)板，使加入的胚胎干細胞均勻分布到飼養(yǎng)層上。

（12）將培養(yǎng)的胚胎干細胞放入培養(yǎng)箱，使克隆重新貼壁。注意：在重新貼壁的這段時間內(nèi)，要盡量少開關培養(yǎng)箱，維持培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定，以利于胚胎干細胞重新貼壁。

（13）每天更換新鮮培養(yǎng)基。注意觀察克隆生長狀態(tài)，在需要時按上述步驟再次傳代。
（七）凍存
（1）按上述步驟收集胚胎干細胞細胞懸液，200 g 離心5 min 。

（2）配好的凍存液（90％胎牛血清，10％DMSO）置于冰上備用。

（3）棄去上清液，將細胞團排松散后用凍存液重懸，逐滴加入凍存液，混勻。一般一個6 孔培養(yǎng)板凍6 支，重懸時每個培養(yǎng)板的細胞加6 mL 凍存液。

（4）迅速將1 mL 細胞懸液裝入1.5 mL 凍存管。蓋緊后放入異丙醇凍存盒中。

（5）將凍存盒降至室溫后，轉(zhuǎn)入-80 ℃ 冰箱，保存過夜。

（6）次日將凍存的細胞轉(zhuǎn)入液氮罐保存。

注意：人胚胎干細胞凍存前不能將細胞消化成單細胞，消化后的細胞團塊稍大為好。

（八）復蘇

（1）將凍存的胚胎干細胞從液氮中取出，浸入37 ℃ 水浴，輕輕轉(zhuǎn)動，注意凍存管蓋不要沒入水中。

（2）當只剩一個小冰晶時，將凍存管從水浴中取出。

（3）將凍存管浸入95％乙醇浴消毒，在無菌超凈臺中晾干。

（4）將細胞從凍存管中轉(zhuǎn)入15 mL 離心管中，逐滴加入4 mL 胚胎干細胞培養(yǎng)基，輕輕混勻。

（5）200 g 離心5 min ，去除凍存液。

（6）去除上清液，將細胞團輕輕拍散，加2.5 mL 胚胎干細胞培養(yǎng)基重懸細胞。

（7）將細胞懸液轉(zhuǎn)移到鋪有照射后的飼養(yǎng)層細胞的6 孔板中。每孔加2.5 mL 細胞懸液。飼養(yǎng)層細胞提前用1 mL PBS洗一遍，去除血清。

（8）放入培養(yǎng)箱，第二天將細胞上面漂浮的死細胞吸去并換液，按常規(guī)方法繼續(xù)培養(yǎng)。

（9）每天觀察細胞密度。按需傳代。
注意事項
（1）所有試劑都應記錄保質(zhì)期和批號，小包裝分裝保存，避免反復凍存。培養(yǎng)基配制后最好在2 周內(nèi)用完。

（2）胚胎干細胞克隆的消化液可有多種選擇，除了上文介紹的膠原酶消化，也可用0.05％的胰蛋白酶消化，消化時間比膠原酶消化所需時間要短，一般1～2 min ，待克隆周邊有皺褶時，要加用MEF培養(yǎng)基中止胰蛋白酶作用，其他步驟基本一致。

（3）用消化傳代的時候務必不能將人胚胎干細胞消化成單個細胞，否則克隆形成率很低。

（4）傳代時細胞密度很重要，人胚胎干細胞一般的傳代比例是1:5～1:10。接種的細胞太少不易生長，最好4～6 d 傳代一次。

（5）人胚胎干細胞對營養(yǎng)要求很高，因此必須每天換液，細胞一般培養(yǎng)在6 孔皿中。

（6）一般使用第2～4 代的小鼠成纖維細胞（MEF）作為飼養(yǎng)層細胞。細胞接種到培養(yǎng)皿后一般在3 d 內(nèi)使用，放置時間過長的飼養(yǎng)層細胞不利于人胚胎干細胞生長。

（7）人胚胎干細胞的培養(yǎng)環(huán)境是37 ℃ ，飽和濕度，5％CO2。培養(yǎng)箱應當每月清洗和衡一次，最好不要在同一培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)其他種類的細胞，以免交叉污染。

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（四）刮細胞

（五）收集并打散克隆

（六）離心傳代

（七）凍存