腫瘤細胞培養(yǎng)實驗

材料與儀器

腫瘤組織
培養(yǎng)液 Hanks 胰蛋白酶 EDTA 膠原酶
培養(yǎng)瓶 培養(yǎng)皿 吸管和膠帽 眼科剪 眼科鑷 二氧化碳培養(yǎng)箱 超凈工作臺

步驟

一、取材

人腫瘤細胞來自外科手術或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉移淋巴結或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進行培養(yǎng)，如因故不能立即培養(yǎng)，可貯存于4 ℃中，但不宜超過24 小時。

二、培養(yǎng)基

腫瘤細胞對培養(yǎng)基的要求不如正常細胞嚴格，一般常用的RPMI 1640、DMEM、Mc-Coy5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細胞培養(yǎng)。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低，正常細胞培養(yǎng)不加血清不能生長，腫瘤細胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。腫瘤細胞對培養(yǎng)環(huán)境適應性較大，是因腫瘤細胞有自泌（Autocrine）性產(chǎn)生促生長物質(zhì)之故。但這并不說明腫瘤組織*不需要這些成分。按不同細胞需要不同的生長因子；腫瘤細胞與正常細胞之間、腫瘤細與腫瘤細胞之間對生長因子的需求都存在著差異。但大多數(shù)腫瘤細胞培養(yǎng)中仍需要生長因子，有的還需特異性生長因子（如乳腺癌細胞等）。總之培養(yǎng)腫瘤細胞仍需加血清和相關生長因子培養(yǎng)更易成功。

三、成纖維細胞的排除

成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養(yǎng)中的關鍵。排除成纖維細胞有多種方法。

(1)刮除法：鏡下觀察腫瘤細胞，并在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底部做下標記，再用無菌膠刮刮除無標記區(qū)域。

(2)反復貼壁法：腫瘤細胞貼壁速度比成纖維細胞慢，把含有兩類細胞的懸液反復貼壁，則成纖維細胞先貼壁而腫瘤細胞后貼壁，來達到分離兩類細胞的目的。

取A、B、C三個培養(yǎng)瓶，先于A中接種入兩種細胞的無血清培養(yǎng)基懸液，5～20min后輕輕將上清液吸出，接種至B，A中加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)B中細胞5～20min后，同樣方法將上清接種至C，再于C中加入*培養(yǎng)基。次觀察三瓶細胞，會發(fā)現(xiàn)成纖維細胞A>B>C，C瓶中主要為腫瘤細胞，如需純化，可反復處理。

(3)酶消化法：成纖維細胞對酶更為敏感，故加入胰酶或膠原酶消化的時候比腫瘤細胞更易于脫落。可于鏡下觀察消化，待成纖維細胞脫落即刻終止消化，反復處理幾次可得較純的腫瘤細胞。

(4)復蘇、傳代和凍存同前。

注意事項

1. 腫瘤細胞的培養(yǎng)也應該遵循無菌操作的原則。

2. 腫瘤細胞在體外不容易培養(yǎng)形成穩(wěn)定的細胞系，故欲獲得好的培養(yǎng)效果應采取一些特別的措施，如加入某種特殊的底物，或者加入促細胞生長因子，甚至需要先用動物轉嫁接種成瘤以獲得更好的活性。

3. 因為某些腫瘤是病毒感染導致，所以腫瘤細胞培養(yǎng)時應注意自我防護。