材料與儀器

mRNA
DTT 蒸餾水 dNTP EDTA SDS 乙醇 聚合酶 瓊脂糖 DNA聚合酶 BSA T4 DNA連接酶 酚 氯仿 異戊醇 PCR純化試劑盒
制冰機(jī) 離心機(jī) 水浴鍋 電泳儀 離心管 移液槍 培養(yǎng)箱

步驟

一、Superscipt II—RT合成第一鏈

1.  在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大約500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)

(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water

（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一鏈，第一鏈合成完畢后將n管合成一管進(jìn)行第二鏈合成。）。

2.  混勻后，70℃反應(yīng)10分鐘。

3.  反應(yīng)完成后，立刻將反應(yīng)體系置于冰上5 min。

4.  稍微離心一下，順序加入以下試劑：

（1）4 ul 5×first strand buffer

（2）2 ul 0.1 M DTT

（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)

5.  混勻，稍微離心反應(yīng)物之后，42℃放置2分鐘。

6.  反應(yīng)完成,趁熱加入1 ul Superscipt II—RT，混勻。

7.  42℃反應(yīng)50分鐘，然后70℃，15分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

二、cDNA第二鏈的合成

1.  第一鏈反應(yīng)完成后，取2ul一鏈產(chǎn)物-20℃冰箱中保存，待電泳檢測(cè)。其余的產(chǎn)物合并，混勻，然后順序加入下列試劑(promega)：

（1）20 ul 10×DNA Polymerase I buffer

（2）6 ul 10 mM dNTP(自己配制)

（3）xul dd H2O

（4）1 ul RNase H(2 U/ul)

（5）10 ul DNA Polymerase I(10 U/ul)

總體系為200 ul。

2.  混勻后，16℃反應(yīng)2.5小時(shí)。

3.  70℃滅活10分鐘。

4.  反應(yīng)完成后，得到200 ul cDNA第二鏈反應(yīng)體系，將此體系置于冰上。

5.  取2 ul二鏈產(chǎn)物，同保存的一鏈產(chǎn)物一起電泳鑒定。同時(shí)上1kb ladder，確定雙鏈的大小范圍。

注：一鏈，二鏈的電泳圖是smear，且二鏈稍比一鏈大一些。

三、 雙鏈cDNA末端補(bǔ)平

1.  在第二鏈反應(yīng)體系中,順序加入下列試劑(promega)：

（1）6 ul 10 mM dNTP

（2）2 ul T4 DNA Polymerase(8.7 U/ul)

（3）2 ul BSA(10 mg/ml)

2.  稍微離心混勻反應(yīng)物，37℃反應(yīng)至少30分鐘，然后75℃滅活10分鐘。

3.  加入等體積酚/氯仿/異戊醇,劇烈振蕩后，常溫下13 000 g離心5分鐘。

4.  離心后，吸取上清于另一1.5 ml eppendof管中，加入等體積氯仿,上下顛倒幾次混勻后，常溫下13 000 g離心5分鐘。

5.  吸取上清至另一eppendof管，加入1/10V 3M NaAc(PH5.2)和2.5 V預(yù)冷的無(wú)水乙醇,混勻，-20℃放置過(guò)夜以沉淀雙鏈cDNA。

6.  第二日，將昨日沉淀物在4℃，13 000g離心60分鐘以充分沉淀雙鏈cDNA。

7.  離心完畢，棄上清,加入1 ml 70%乙醇洗滌沉淀,常溫下13 000 g離心5分鐘。

8.  離心完畢，棄上清，干燥沉淀至無(wú)乙醇?xì)馕丁?/p>

注：第3，第4步可以用PCR 純化試劑盒代替。

四、PCR純化試劑盒操作流程

1.  溶液PE使用前應(yīng)加入適量體積95%－100%的乙醇，混勻。

2.  向200 ul二鏈補(bǔ)平產(chǎn)物中加入5倍體積的buffer PB，混勻。

3.  加入spin column中，13 000 rpm離心1 min。

4.  加入0.75 ml buffer PE，13 000 rpm離心1 min。

5.  13 000 rpm，再離心1 min。

6.  將spin column放入一新的離心管中，加入50 ul buffer EB，靜置10 min。

7.  13 000 rpm離心2 min。

8.  加入30 ul buffer EB，靜置10 min。

9.  13 000 rpm離心2 min。

10.  加入1/10體積3M的NaAc，2.5倍體積無(wú)水乙醇，混勻，－20℃沉淀過(guò)夜。

五、 EcoR I adaptor 加接

1.  往雙鏈cDNA沉淀中加入9 ul EcoR I adaptor(400 ng/ul)，4℃至少放置30分鐘以充分溶解cDNA沉淀。

2.  溶解完成后,順序加入下列試劑：

（1）1.2 ul 10×Ligase Buffer

（2）1 ul 10 mM rATP

（3）1 ul T4 DNA Ligase(4 U/ul)

3.   混勻后，4℃連接3days或者8℃過(guò)夜連接。

六、 雙鏈cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切

1.  連接反應(yīng)完成后,將反應(yīng)體系70℃放置15分鐘滅活T4 DNA Ligase。

2.  稍微離心使反應(yīng)物集中至管底，室溫下放置5分鐘,然后加入下列試劑：

（1）1 ul 10×Ligase Buffer

（2）1 ul 10 mM rATP

（3）6 ul dd H2O

（4）1 ul T4 PNK(10 U/ul)

3.  37℃反應(yīng)30分鐘,然后70℃滅活15分鐘。

4.  稍微離心使反應(yīng)物集中至管底。

5.  室溫放置5分鐘;然后加入下列試劑：

（1）4 ul Xho 10×Buffer

（2）2 ul BSA

（3）5ul ddH2O

（4）8ul Xho I (10 U/ul)

6.  37℃反應(yīng)1.5小時(shí),然后65℃滅活酶10分鐘。

7.  反應(yīng)完成，雙鏈cDNA合成完畢。置于4℃準(zhǔn)備回收。

七、膠回收cDNA

1.  配制小膠數(shù)板（每個(gè)樣品一板）：1%瓊脂糖凝膠，2 ul EB/300 ml 膠。

2.  取4℃保存樣品上樣，40 ul/孔。

3.  電泳50 V，1 h。

4.  紫外燈下分別切下500~1 kb、1.0-2.0 kb及2.0-4.0 kb cDNA 片段.，分別放入已做標(biāo)記的1.5 ml離心管中。

5.  稱(chēng)取膠重，加入三倍體積buffer QXI（例如，100 mg膠中加入300 ul buffer QXI）。

6.  50℃ 水浴數(shù)分鐘，至膠*融化。用手指彈 QIAEX II 使重懸，每管中加入5 ul QIAEXII。

7.  50℃ 水浴10 min，每隔2 min 取出顛倒混勻數(shù)次，使QIAEX II 保持懸浮。

8.  4℃，13 000 rpm，30 s （棄上清，離心機(jī)中甩一下，吸取上清）。

9.  加入500ul buffer QXI，輕彈管底使QIAEX II 重懸。

10.  離心并去上清（同操作8）。

11.  加入500 ul buffer PE，重懸QIAEX II，離心30 s，去上清。

12.  再加入500 ul buffer PE，重懸QIAEX II，離心30 s，棄上清，離心機(jī)中甩一下，吸去上清。

13.  超凈臺(tái)上吹干（至無(wú)乙醇味），加入10 ul elution buffer，重懸QIAEX II，靜置5 min，13 000 rpm，30 s。吸上清，冰上放置。

14.  取1 ul上清上樣電泳，同時(shí)做分子量標(biāo)準(zhǔn)（1 kb ladder）及DNA含量標(biāo)準(zhǔn)（10 ng，20 ng）作對(duì)照。

15.  將收回的cDNA置于-20℃內(nèi)保存，據(jù)電泳結(jié)果，取適量DNA進(jìn)行連接。

注意事項(xiàng)

1.  RNA 的提取（例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍—有機(jī)溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定）。

2.  要構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的 cDNA 文庫(kù)，獲得高質(zhì)量的 mRNA 是至關(guān)重要的，所以處理 mRNA 樣品時(shí)必須仔細(xì)小心。

3.  由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境，因此建立一個(gè)無(wú) RNA 酶的環(huán)境對(duì)于制備優(yōu)質(zhì) RNA 很重要。

4.   文庫(kù)構(gòu)建要選擇合適的載體，常規(guī)用的是 λ-噬菌體，這是因?yàn)?nbsp;λ-噬菌體 DNA 兩端具有由12個(gè)核苷酸的粘性末端，可用來(lái)構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源 DNA。  

常見(jiàn)問(wèn)題

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