細胞培養(yǎng)常見問題及解答（二）

接上一期，本期我們繼續(xù)分享細胞培養(yǎng)常見的問題吧~

12. 附著性細胞繼代時所使用的trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？

一般使用的trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于-20 ℃，避免反復冷凍解凍造成trypsin 的活性降低，并可減少污染的機會。

13. 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？

回收動物細胞，其離心速率一般為300xg (約1 000 rpm)，5-10 分鐘，過高的轉速，將造成細胞死亡。

14. 細胞冷凍培養(yǎng)基的成份為何？

動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原來細胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。

15. DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何？

冷凍保存使用的DMSO 等級，必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于4℃，避免反復冷凍解凍造成DMSO 的裂解而釋出有害物質，并可減少污染的機會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO 的Nylon 材質濾膜。

16. 冷凍保存細胞的方法？

冷凍保存方法一：冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20℃ 30 分鐘*) → -80℃16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二：冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃至-80℃以下，再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20℃不可超過1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟，接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

17. 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？

冷凍管內細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。 

18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？ 

除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。

19. 應如何避免細胞污染？

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細胞等。嚴格的無菌操作技術、清潔的環(huán)境、與品質良好的細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染的最好方法。當然，適當添加抗生素也是防止細胞污染的途徑。

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