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成年大鼠心室肌肉細胞的分離和培養(yǎng)實驗方法步驟
發(fā)布時間： 2021-11-16 點擊次數： 2023次材料與儀器
鼠
KH 緩沖液 混合氣體
對流工作臺或層流式超凈臺 乙（酉迷）罩 冷凝器 循環(huán)水浴和水浴搖床 圈型架 蠕動泵 臺式醫(yī)用離心機 無菌燒杯 ColorpHast pH 試紙步驟
一、ARVM 細胞分離的準備工作
1. 準備如下設備及器材：
對流工作臺或層流式超凈臺
乙（酉迷）罩
冷凝器
循環(huán)水浴和水浴搖床
帶夾的圈型架
免蠕動泵
臺式醫(yī)用離心機
95% O2 5% CO2 混合氣體
400 ml 無菌燒杯
ColorpHast pH 試紙（精密型）
2. 在對流式或層流式工作臺中，裝配 Langedorff 系統(tǒng)，把冷凝器和三通管夾著固定在圈型架上，管子接上蠕動泵。冷凝器連接 37℃ 循環(huán)水浴，這樣溫水從冷凝器底部流進從頂部流回水浴。
3. 在工作臺的無菌區(qū)域，布置下列無菌器械，這些可以是高壓滅菌過的或一次性無菌器材：
組織鉗
大號剪刀
彎頭小夾子 2 個
小剪刀
蚊式止血鉗
Swinnex 25 mm 規(guī)格的濾器支架
250 ml 燒杯
玻璃管和硅膠管
帶螺蓋的，50 ml 錐形瓶，內加小攪拌棒
帶螺蓋的 250 ml 錐形瓶
一次性培養(yǎng)皿，吸管，60 ml 注射器，15 ml 和 50 ml 離心管，縫合線
4. 準備加 CaCl2 和不加 CaCl2 的 Krehs-Henseleit（KH）培養(yǎng)基，過濾除菌 37℃ 保溫。
5. 充氧飽和 KH 緩沖液和無鈣 KH 培養(yǎng)基直到 pH 值約 7.4。轉移 150 ml 氧飽和的無鈣 KH 緩沖液至無菌的 250 ml 帶螺帽錐形瓶中并置于 37℃ 水浴。螺帽務必蓋好。
6. 制備酶溶液Ⅰ。裝有氧飽和的無鈣 KH 緩沖液的錐形瓶中加 75 mg 的膠原酶和 45 mg 的透明質酸酶。
7. 制備酶溶液Ⅱ。取 21 ml 溶液Ⅰ轉移至一支新管中，加 2 ml 胰酶和 20 μl 無菌 1 mol/L CaCl2 過濾除菌。膠原酶/透明質酸酶溶液移至一無菌的 250 ml 的帶螺帽錐形瓶中，膠原酶/透明質酸酶/胰酶液移至一無菌的 50 ml 帶螺帽錐形瓶中。
8. 往第一個 250 ml 燒杯中加 150 ml KH 緩沖液，并加入灌注系統(tǒng)，避免產生氣泡。在插管處檢查流過液的 pH 值，通以 95% O2/5%CO2 氣體將 pH 值調回 7.4。流出液體回收到無菌 400 ml 燒杯中。
9. 用預溫的 KH 緩沖液覆蓋整個平皿底。
10. 把第一只鼠放進乙（酉迷）罩中麻醉。
11. 把充過氧的無鈣 KH 緩沖液放進第二只 250 ml 無菌燒杯中，將流速調高至 5.5 ml/min，灌注 6 分鐘。
12. 酶溶液Ⅰ放進第三只 250 ml 燒杯中，泵速度調節(jié)至 8 ml/min，灌注 5 分鐘。把該 250 ml 燒杯放在心臟下面繼續(xù)重新灌注心臟 15 分鐘以上。
二、解剖動物和灌注心臟
1. 動物*麻醉后，放在 Langendorff 裝置的附近。動物平躺放置，用乙醇浸潤胸部剪開胸部皮毛。
2. 用大剪刀在肋骨下切一橫向切口打開胸腔，然后切開胸膈膜。
3. 提起劍突，胸中線兩邊約 2 cm 處沿肋骨各做一條徑向切口，千萬不要觸及心臟。
4. 用夾子掂起心臟，剪斷下方的連接，摘下心臟和胸腺，摘下的心臟放在裝有 KH 溶液的佩特里氏平皿，然后轉到支著灌注設備的工作臺上。
5. 把心臟移到平皿的邊緣，提起胸腺露出主動脈，用小剪刀剪掉胸腺。
6. 打開泵，流速調至約每秒一滴。雙手穩(wěn)握兩把小鉗子，使主動脈沿插套滑動至插套管底部位于心臟的頂部。
7. 用蚊式止血鉗固定住心臟，鉗子夾著主動脈底部并保證止血鉗夾著主動脈上端。
8. 在止血鉗下部，用縫合線牢固地綁住心臟，灌注 3~5 分鐘使心臟血*排出。
9. 從心臟上剔除殘余組織，保持肺動脈以及動脈附屬件的完整性。
三、心臟組織的消化
1. 酶溶液Ⅰ進行灌注的最后 2 分鐘時，用 colorp Hast 試紙檢查液體的 pH 值，若有必要，通氣調節(jié) pH 至 7.4。
2. 從插套管上割下心室并仔細切成 1 mm2 的小塊。轉入裝有酶溶液Ⅱ 的 50 ml 錐形瓶中，于 37℃ 水浴，100 r/min 搖動孵育 15 分鐘。
3. 用 5 ml 吸管稍微吹打上述樣品后轉入一支 50 ml 錐形離心管中加 20 ml 洗滌培養(yǎng)基。
4. 一支 60 ml 注射器，拿掉推桿，裝上 Swinnex 濾器。往針筒內加入細胞懸液，把細胞過濾到一支新管中。
5. 500 r/min（50 g）離心 30 秒，去上清后，細胞重新溶于 10 ml 新的洗滌培養(yǎng)基中。
6. 讓梭形細胞沉降 20 分鐘，小心去上清，用 10 ml 新洗滌培養(yǎng)基重懸細胞。
7. 讓細胞沉降 15 分鐘，去上清，用 10 ml 洗滌培養(yǎng)基重懸細胞。
8. 重復上述洗滌步驟，共洗 4 次，最后一次洗滌后，倒去上清。加入 5 ml 洗滌培養(yǎng)基。
9. 重懸細胞后小心鋪放在 DMEM 配制的 6% BSA溶液上層，讓梭形細胞沉降 10~15 分鐘。
10. 最后的細胞團應包含高比例的活的梭形心室心臟細胞。每只心臟若能收到 3X106 個細胞就很不錯了。
四、ARVM 細胞的培養(yǎng)
1. 在上述細胞洗滌的同時，準備包被平板/蓋玻片/載玻片于室溫，用 10 μg/ml 層黏素溶液浸沒 30 分鐘。
2. 加入適量的培養(yǎng)皿重懸最后所得的細胞團，并以每只 100 mm 規(guī)格平皿 1X106 個細胞的量接種至已包被過的平板上。
3. 讓細胞貼壁 1 小時，然后換新的培養(yǎng)基連續(xù)孵育。用加血清或不加血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 1 或 2 周。
4. 細胞隔天換液。
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