細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)技術(shù)——功能實(shí)驗(yàn)的第一步

轉(zhuǎn)染(transfection)是真核細(xì)胞主動(dòng)或被動(dòng)導(dǎo)入外源核酸片段（DNA或RNA）而獲得新的表型的過程。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生重組蛋白，或者特異性的增強(qiáng)/抑制細(xì)胞中的基因表達(dá)。轉(zhuǎn)染后的檢測主要包括基因水平和蛋白水平的檢測。一定時(shí)間后收集轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞，采用超聲或酶解的方法破碎細(xì)胞，離心得到上清。針對(duì)基因水平，使用普通 PCR 或 RT-PCR 進(jìn)行驗(yàn)證，蛋白水平，使用 western blot 檢測，簡單，快速，準(zhǔn)確。

轉(zhuǎn)染的類型

根據(jù)導(dǎo)入的核酸存在于宿主細(xì)胞的時(shí)間長短，可以分為瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)。根據(jù)轉(zhuǎn)染方式可以分為化學(xué)方法，生物方法，物理方法。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是指將構(gòu)建好的質(zhì)粒或者siRNA通過某種方式導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)（常用的工具細(xì)胞 HEK293 細(xì)胞），該外源核酸片段不整合到細(xì)胞自身的基因組上。隨著細(xì)胞的生長分裂，外源基因會(huì)逐漸丟失，在細(xì)胞內(nèi)能夠存在 3-4 天，無法隨著細(xì)胞的分裂進(jìn)入到子代細(xì)胞中。在這一段時(shí)間內(nèi)，外源基因在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)錄翻譯，得到少量的蛋白。根據(jù)使用的載體不同，收集目的基因/蛋白進(jìn)行檢測的時(shí)間不同，通常在轉(zhuǎn)染后48h，目的蛋白的表達(dá)水平最高。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)是短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行蛋白的小量制備，滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是外源DNA整合到細(xì)胞基因組中，成為細(xì)胞基因組的一部分從而得以復(fù)制，隨著細(xì)胞分裂，子代細(xì)胞也同樣表達(dá)外源基因，這就是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的標(biāo)志。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是建立在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上的，先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，再對(duì)得到的細(xì)胞池進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)記是抗生素，熒光報(bào)告基團(tuán)等，通常需要2-3周的篩選時(shí)間，由此形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)是能夠得到蛋白的大量、長期生產(chǎn)，滿足后續(xù)的一系列體內(nèi)體外的表型實(shí)驗(yàn)。

轉(zhuǎn)染方式

考慮到轉(zhuǎn)染效率是影響細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的重要因素，因此選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染方式很關(guān)鍵。下面我們介紹一下常見的轉(zhuǎn)染方式。

細(xì)胞由帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成，對(duì)于也帶負(fù)電荷的核酸片段（DNA和RNA）來說是不可透過的屏障，因此研究人員開發(fā)了很多方法能使核酸穿透細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，大致分為三類：

細(xì)胞由帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成，對(duì)于也帶負(fù)電荷的核酸片段（DNA和RNA）來說是不可透過的屏障，因此研究人員開發(fā)了很多方法能使核酸穿透細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，大致分為三類：

轉(zhuǎn)染的影響因素：

轉(zhuǎn)染過程中許多因素會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率：如細(xì)胞類型；細(xì)胞密度；質(zhì)粒大小、質(zhì)粒純度；血清；轉(zhuǎn)染試劑等。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，以下幾個(gè)因素進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化：

1. 轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞狀態(tài)和密度

轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度以 50-80%最佳，細(xì)胞密度過高會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率（周期進(jìn)程阻滯，凋亡增加等）。同時(shí)支原體污染會(huì)嚴(yán)重降低細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，因此轉(zhuǎn)染前可用環(huán)丙沙星處理細(xì)胞以除去支原體。

2. 轉(zhuǎn)染時(shí)的質(zhì)粒純度

如果提取的質(zhì)粒不純，如帶少量鹽離子，蛋白、代謝物污染等都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成；而含有內(nèi)毒素的質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞存在很大的毒性作用（一般用去內(nèi)毒素的提取試劑盒）。抗生素一般對(duì)真核細(xì)胞無毒，但轉(zhuǎn)染過程中細(xì)胞通透性增加，會(huì)使抗生素進(jìn)入細(xì)胞，從而降低細(xì)胞活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。

3. 轉(zhuǎn)染后的篩選時(shí)間

轉(zhuǎn)染后篩選不能太早或太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷大，增殖較慢，太晚會(huì)被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆。一般要在轉(zhuǎn)染后48h之后開始加抗生素篩選。

4. DNA 與轉(zhuǎn)染試劑的比例

許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化 DNA 與轉(zhuǎn)染試劑的比例。不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率差別很大，通常需要根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇合適濃度的外源DNA或RNA，調(diào)整外源核酸片段和轉(zhuǎn)染試劑的比例。