酵母雜交實驗——從一無所知到略知一二

低分文章要想逆襲，實現向高分文章的跳躍，就一定少不了要將細胞豪門中分子間錯綜復雜的關系屢屢清楚。為了找尋能讓自家目的蛋白榮登科研“頭條榜"的“花邊新聞"，一眾科研者可謂是操碎了心。慶幸的是，酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）和酵母單雜交（Yeast One-Hybrid，Y1H）實驗讓蛋白質與其好友（蛋白質、DNA、RNA）的關系在科研者面前變得無所遁形。

蛋白釣魚術——酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）

通常一個蛋白在本性上可以同時喜歡很多其他的蛋白，但最終還是會有個最喜歡的，而在 Y2H 中就能發現他的喜好。換言之，Y2H 就是研究一群男女間的自由戀愛問題，而它為兩個蛋白牽線拉橋的方法，簡單概括起來就一句話：廣撒網，釣大魚。

首先，把目的基因構建成 DNA 結合質粒（BD 質粒）轉入 a 型酵母中形成釣餌（Bait）；其次將全 cDNA 片段構建的轉錄激活質粒（AD 質粒）轉化到 b 型酵母中，每個 b 型酵母含有一個隨機的 AD 質粒，就形成了酵母庫；最后利用酵母接合生殖的特征使得 AD 和 BD 兩個質粒 同時進入到一個酵母中，當目的蛋白和酵母庫中 AD 質粒所表達的蛋白相“合拍"時，質粒上的氨基酸合成基因就會被啟動激活，使得酵母可以在營養缺陷型的培養基上生長了，這樣就 弄清楚誰才是目的蛋白的“命中真愛"了。 

然而在 Y2H 中，由于酵母庫的構建是通過 cDNA 片段鏈接到質粒上的，經常會產生 2/3 移碼突變的假陽性。因而，在研究蛋白質互作過程中，在用 Y2H 來篩選出相關蛋白后，還需用 Co-IP 和 GST pulldown 進行驗證，看看目的蛋白對“真愛"是否做到了“沒有你不行"又或者可能“腳踏兩只船"還擁有其他的新伙伴。總之，只有依靠縝密的陰性、陽性對照才能真正在蛋白實驗中披沙揀金、去偽存真。

DNA 識別者——酵母單雜交（Yeast One-Hybrid，Y1H）

而一提及蛋白質與 DNA 之間千絲萬縷的關系，各位小伙伴立刻會向 ChIP-qPCR，ChIP-RNAseq 或熒光素酶報告實驗等“神助攻"來尋求幫助。 

可是你造么？通過酵母單雜交（Y1H），可快速鑒定與感興趣的特定調節 DNA 序列（bait 序列）相互作用的蛋白質，除了“明星蛋白"異源轉錄因子，還可找到一些其他“幕后英雄"，如 DNA 復制蛋白、修復蛋白及抑制蛋白。更重要的是，Y1H 還有著一項得天獨厚的優勢：可檢測蛋白異構體（isoform）與 DNA 特異性相互作用，而這正是依賴于敏感和特異性抗體綁定到特定靶蛋白的 ChIP 很難做到的。

舉個栗子，當通過各類芯片篩選出了一個在腫瘤組織中異常高表達的差異基因 A，可通過 Y1H 實驗為其組織一場相親大會：即將構建含有報告基因（基因 A 作為 Bait 序列）的酵母單細胞株，與后續導入該菌株的表達特定蛋白的表達質粒庫“見面"，如果某蛋白能與上游的 Bait 序列“情孚意合"，可使融合激活結構域（AD）與報告基因的啟動子元件緊密接近，從而激活報告基因的下游轉錄，使得酵母可以在營養缺陷型的培養基上生長。接下來就可對該蛋白調控基因 A 的機制進行深入研究。 

然而，任何篩選都存在假陽性，Y1H 也不例外；且 Y1H 不提供關于 DNA-蛋白質相互作用的功能性后果的任何信息。可見在生物實驗中，單一的證據都是薄弱的，無論它貌似多么正確，也要通過對照和多方取證才能確定真正的事實。 

升級版——酵母三交技術（Yeast Three-hybrid，Y3H）

目前，從基本科學和臨床角度上，通過 Y3H 來理解與 RNA 病毒相關的疾病過程是很重要的。而在具體的實踐過程中，Y3H 可以用于篩選 RNA 文庫以及 cDNA 文庫。由于 Y3H 在現階段還是一種新技術，所以迄今為止對其的相關報道還是比較少的。

參考文獻： 

1）An Overview of Yeast Two-Hybrid (Y2H) Screening 

2）An overview of the Yeast one-hybrid assay 

3）Two Hybrid Services