小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7）的培養(yǎng)要點及高效轉(zhuǎn)染試劑

  小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7）是通過Abelson鼠白血病病毒誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生腫瘤后得到的細胞株。其在醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用十分普遍，是許多白血病相關(guān)研究模型的常用細胞株，在微生物學(xué)、免疫學(xué)等研究中也十分常用。但RAW264.7細胞形態(tài)和分化狀態(tài)多變，在實際培養(yǎng)中較難把握，給科研工作帶來了一定困難；且RAW264.7細胞很難轉(zhuǎn)染，許多研究者表示Lipofectamine 2000根本轉(zhuǎn)不進去，或者僅有不到10%的轉(zhuǎn)染效率。因此RAW264.7細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法就很值得去探討，本文就這些方面進行介紹，以供科研工作者借鑒。

一、RAW264.7細胞的形態(tài)特征

       很多人養(yǎng)RAW264.7細胞時發(fā)現(xiàn)自己的細胞出現(xiàn)偽足；就連ATCC的描述也稱RAW264.7細胞形態(tài)多樣，可有圓形、類圓形，以及長出偽足的長梭形、多邊形，可單核可多核。而實際，有偽足的情況是RAW264.7細胞受到外界刺激進行了分化，是細胞衰老、分化的表現(xiàn)；RAW264.7細胞的“最佳"形態(tài)應(yīng)是較小的單核圓形細胞。

二、RAW264.7細胞的培養(yǎng)條件

       RAW264.7細胞的培養(yǎng)環(huán)境與一般貼壁細胞并無差異。即培養(yǎng)箱溫度為37℃，CO2濃度為5%。ATCC推薦的培養(yǎng)基為DMEM+10%的胎牛血清；實際上，經(jīng)研究者們實驗發(fā)現(xiàn)高糖型DMEM培養(yǎng)的RAW264.7細胞傳代后貼壁更快、細胞生長速度更快。因此，推薦使用高糖型DMEM，F(xiàn)BS濃度為10%，作為RAW264.7細胞的培養(yǎng)基。

三、RAW264.7細胞的傳代

       關(guān)于RAW264.7細胞的傳代方法，ATCC推薦使用細胞刮刀。也可采用0.25%的胰酶消化或采用彎嘴吸管吹打等方法。采用細胞刮刀進行傳代時，細胞能最大限度被收集起來，但會對細胞造成機械性損傷、影響細胞形態(tài)及貼壁時間等。采用胰酶消化時，由于RAW264.7細胞貼壁較牢，消化時間就較長。但消化時間點不易把握，易消化過度，對細胞生長造成抑制。

       因此，推薦使用彎嘴吸管吹打進行傳代。具體做法是，當(dāng)細胞達到傳代密度時，先棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，用彎嘴吸管吸取培養(yǎng)基，均勻、稍用力吹打瓶底，即可將細胞吹打下來（吹不下來的就不要了），離心后重懸即可分瓶培養(yǎng)。2 h后可見細胞貼壁。

由于RAW264.7細胞生長速度較快，一般1-2d換液1次，密度長至60%-70%左右即可傳代，傳代比例可為1:3-1:6。若傳代間隔太久，細胞生長密度過大，細胞也容易發(fā)生分化，出現(xiàn)長偽足的多形細胞。

四、RAW264.7細胞的凍存及復(fù)蘇

       RAW264.7細胞的凍存及復(fù)蘇方法與一般貼壁細胞并無較大差別。但由于RAW264.7細胞對外界刺激較敏感，對營養(yǎng)條件要求較高，許多人建議降低DMSO的濃度，增加FBS血清的濃度。因此凍存液的推薦配方為5% DMSO和20% FBS的培養(yǎng)基（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞的培養(yǎng)及其在誘導(dǎo)破骨細胞中的應(yīng)用，許丹等，中國骨質(zhì)疏松雜志，2016, 10, 22, 10）。

五、RAW264.7細胞的轉(zhuǎn)染

（一）以往轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)

      RAW264.7細胞是一種巨噬細胞，有很強的貼壁性和偽足產(chǎn)生性，其轉(zhuǎn)染較難，一般采用電轉(zhuǎn)或慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)的方法。有研究者對RAW264.7細胞用幾種不同的轉(zhuǎn)染方法進行處理，對轉(zhuǎn)染效率進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（Lipofectamine 2000, Invitrogen）效率很低，僅為12.17±1.53%，慢病毒轉(zhuǎn)染效率是最高，可達34.75 ± 5.30%，羅氏轉(zhuǎn)染（X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent, Roche）和電穿孔轉(zhuǎn)染效率分別為16.52 ± 3.86%和15.73 ± 3.29%（巨噬細胞RAW264.7不同轉(zhuǎn)染方法的比較，李亞等，生物技術(shù)，2014, 24, 2）。

（二）最新高效轉(zhuǎn)染試劑

       既然RAW264.7細胞這么難轉(zhuǎn)染，實驗還得繼續(xù)，那怎么辦呢？

       目前ZETA LIFE新推出一款A(yù)dvanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑。其廣泛適用于貼壁細胞和懸浮細胞的轉(zhuǎn)染，可轉(zhuǎn)DNA、RNA，也可共轉(zhuǎn)染，還可進行小動物活體轉(zhuǎn)染。

這一款轉(zhuǎn)染試劑有以下幾個特點：

       1.適用細胞廣

       廣泛用于293T，9L，A172, A375, A549, COS7, CHO-K1, C6S, C2C12, NIH3T3, RG2, T98G, U87, U118, MDCK, MCF-7, HT1080, HEK, H4, RAW264.7等多種細胞系。

      2.細胞毒性低

      其最高細胞存活率可高達98%，平均細胞存活率可達80%。

       3.轉(zhuǎn)染效率高

       其最高轉(zhuǎn)染效率可高達96%，平均轉(zhuǎn)染效率可達70%。

（三）Advanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進RAW264.7的實例（來自實驗者的實際數(shù)據(jù)）

由上圖可明顯看出Advanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑對RAW264.7轉(zhuǎn)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率高達95%以上，且細胞存活率較高。

       相信Advanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑 將是您對的選擇，希望能為您的研究助力。

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